El analizador de estabilidad proteica PSA - 16 ayudó a los investigadores del Instituto de biología de la Universidad Tecnológica de Qilu (academia de Ciencias de shandong) a publicar en abril de 2025 el trabajo "estructura - Guía de alta fusión estable ingeniería a sí misma - assemble con Cellulose modified Electronic for Enhanced uric design" en la revista International Journal of Biological macromolecules.

Xingbao Wang, Weili Gong, Yunlong Xue, Yi Yu, Xiaozhen

Huang, Yue Shao, Xuan Li, Xin Wang, Chunyu Song, Binglian

Wang, Lihe Zhang y Yaohong Ma

PII: S0141-8130(25)04227-8

La estabilidad térmica de las proteínas se refiere a la capacidad de deformación de las cadenas de polipéptidos de las proteínas bajo la influencia de la temperatura, que se refleja principalmente en las propiedades químicas y los cambios en la conformación espacial de las cadenas de polipéptidos cuando la temperatura cambia, cuanto menor es el cambio, mayor es la estabilidad térmica. La estabilidad térmica de las proteínas se ve afectada por factores externos como diferentes temperaturas, pH e intensidad iónica, que son de gran importancia en los campos de la biotecnología, la investigación y el desarrollo de medicamentos y la industria alimentaria.

La temperatura de desnaturalización de las proteínas es un concepto importante para que los biólogos estudien la estabilidad térmica de las proteínas, que se refieren a los cambios estructurales de las proteínas cuando se calientan y las proteínas cambian de estructuras tridimensionales estables a estructuras desordenadas sueltas. La estabilidad térmica de las proteínas se indica generalmente por la temperatura de fusión (temperatura de fusión, tm, también conocida como temperatura de desnaturalización térmica), es decir, la temperatura al 50% de la proteína cuando se deshace.

01 Prólogo

La Alta estabilidad y la actividad catalítica reservada en la fijación de la enzima del ácido úrico (uox) son las claves para lograr un sensor preciso del ácido úrico (ua). Este estudio ha desarrollado un Biosensor electroquímico de ua basado en uox fijo autoensamblado para promover la detección de UA mediante la fusión de módulos de unión a carbohidratos (cbm) en electrodos modificados por celulosa. Con la ayuda de la estrategia de ingeniería enzimática orientada a la estructura computacional, se demuestra que la estabilidad estructural de la fusión CBM 3 en el extremo n es mejor que la de CBM 3 o cbm2 en el extremo c. Se eliminaron aún más los residuos del extremo n de CBM 3 (p2vsg5) y los residuos de la zona de conexión (k158epmsn163), que predicen que son perjudiciales para la estabilidad estructural de CBM 3 - uox, y se construyó CBM 3 - △ 10aa - uox, que mejoró significativamente la fiabilidad de los biosensores de UA en comparación con los biosensores de uox entrelazados Con glioxal (0 - 0375 mm, 5 días), mostrando una relación lineal entre 0 y 0625 mm de ua. R2 > 0.99， Puede durar 20 días. Además, a través de la coinmobilización de los tipos silvestres uox y cbm3 - Δ10aa - uox (0 - 0875 mm, > 34 días, R2 > 0.99）， Se ha explorado el mecanismo de fusión del aumento de la corriente de uox en la fase inicial y se ha atribuido a la interacción entre las subunidades de uox y a la ruptura del péptido de conexión, demostrando además que la mayor estabilidad del péptido de conexión cbm3 - △ 10aa - uox puede prolongar el proceso de aumento de la corriente y aumentar la vida útil. Este estudio destaca la efectividad de la fijación de Autoensamblaje en el campo de la propulsión de biosensores y proporciona estrategias sólidas para la evolución de biosensores similares a los poliméricos.

02 Resumen

El ácido úrico (ua) es un compuesto nitrogenado clave ampliamente presente en líquidos biológicos como el suero y la orina, y es el principal producto final del metabolismo de la purina. Los niveles normales de UA en suero de individuos sanos son de aproximadamente 0,21 - 0,43 mmm en hombres adultos y de aproximadamente 0,15 - 0,36 mmm en mujeres adultas, respectivamente, mientras que en pacientes con gota las concentraciones de ua pueden alcanzar hasta 1,49 - 4,46 mmm. las anomalías en los niveles de UA en el líquido biológico pueden sugerir enfermedades como gota, Síndrome metabólico y enfermedad renal, convirtiéndolas en biomarcadores útiles para detectar enfermedades relacionadas con el metabolismo de la purina. Por lo tanto, la detección rápida y confiable de UA en el líquido biológico suele ser crucial para su diagnóstico y tratamiento.

En la actualidad, se han desarrollado una variedad de métodos para la determinación de la ua, entre ellos la Cromatografía líquida de alto rendimiento (clar), la espectrometría de masas de dilución isotópica (id - ms), la espectrometría de masas de iones, la espectrometría de masas de dilución isotópica (id - ms) y los métodos de Biosensor electroquímico. Entre estos métodos, los biosensores enzimáticos tipo corriente basados en la catálisis redox de la urasa (uox o urasa, EC 1.7.3.3) han recibido una amplia atención de investigación por su simplicidad, sensibilidad, especificidad y respuesta rápida. La ecuación de reacción de uox es la siguiente: UA + 2h2o + O2 allantoína + H2O2 + co2. Durante el proceso de biosensorización, el uox fijado al electrodo reacciona con la ua, consume O2 y produce h2o2. La reducción de O2 o el H2O2 oxidativo es proporcional a la concentración de ua, y la señal de oxidación o reducción se puede convertir y ampliar a una señal física legible a través de un sensor y un amplificador electrónico. Por lo tanto, la Alta estabilidad de la uox fija y la actividad catalítica mantenida son las claves para lograr la detección precisa de ua.

En estudios previamente reportados, se han construido biosensores de UA de tipo actual utilizando diferentes tipos de técnicas de fijación enzimática. Los métodos de adsorción física y enterramiento se utilizan comúnmente para la fijación de uox, pero su proceso de adsorción tiene una fuerza de unión débil y es vulnerable a los cambios ambientales, lo que reduce la estabilidad de funcionamiento y almacenamiento de los biosensores correspondientes. El enterramiento de uox se realiza generalmente con polímeros como la Polianilina (pani) y el polipirrol. Sin embargo, la fuga de enzimas fijadas de estos polímeros puede afectar su estabilidad. Los métodos de unión covalente y enlace cruzado que utilizan reactivos bifuncionales como el glioxal o la carbondiimina para formar un enlace covalente estable entre la enzima y el vector o la seroalbúmina bovina (bsa) también son métodos comunes para la fijación química de uox, evitando la desorción y fuga de la enzima. Sin embargo, la amplia inactivación enzimática y la baja repetibilidad causada por el método de unión covalente limitan su aplicación en biosensores. Recientemente, el método de adsorción de afinidad ha demostrado ser una estrategia prometedora de fijación enzimática que puede mejorar el rendimiento de los biosensores enzimáticos. Además, el módulo de unión a carbohidratos (cbm2) de la familia 2 se fusiona con la glucosa Oxigenasa a través de la ingeniería genética para promover el rendimiento de detección de glucosa. Sin embargo, la estructura y el mecanismo catalítico de la uox son diferentes de los de la glucosa oxigenasa, por lo que explorar la construcción de una uox de fusión CBM estable y activa como elemento Biosensor de la UA sigue siendo crucial.

Uox es una estructura de barril de tetraméricos funcionales cuyo sitio activo está formado por residuos de interfaz de dos monómeros. Cada monómero contiene dos dominios idénticos con una estructura súper secundaria antiparallel beta alfa beta, llamada dominio plegable del túnel. Algunas interacciones débiles (enlaces no covalentes, enlaces secundarios), incluyendo van der waal, enlaces de hidrógeno, enlaces de sal (enlaces de disociación) e interacciones hidrofóbicas, participan en la estabilización de estructuras de cuatro niveles. Además, la disposición complementaria de los grupos polares e hidrofóbicos en las interfaces estrechas formadas entre las subunidades promueve la Asociación de subunidades específicas. En el proceso catalítico de uox, la química de O2 se promueve y controla sin cofactores, proponiendo diferentes mecanismos catalíticos similares a la enzima enzimática dependiente de la flavina o la Monooxigenasa dependiente de la flavina, pero su mecanismo de acción aún no se ha aclarado. Debido a la actividad catalítica dependiente de múltiples subunidades y el mecanismo catalítico inexistente de uox, hay menos informes de investigación sobre la mejora del rendimiento de uox de ingeniería en las últimas décadas. Por lo tanto, la construcción de una fusión genética estable uox es un desafío importante.

La fusión en serie es una estrategia popular y factible para construir proteínas de fusión sintéticas. Al utilizar esta estrategia para obtener la proteína de fusión ideal, se deben considerar cuidadosamente dos elementos: el orden óptimo de colocación del dominio entre los socios de fusión y la selección del conector adecuado para conectar el dominio de la proteína juntos. El diseño ciego de las proteínas de fusión puede causar múltiples consecuencias adversas, incluyendo plegado incorrecto del dominio, bajo rendimiento de proteínas y disminución de la actividad biológica. Gracias a la notable evolución de programas informáticos dedicados a la predicción de la estructura de las proteínas y al diseño racional de las proteínas, como alphafold2, procheck, autodock Vina y gromacs, se puede entender mejor la estructura de las proteínas de fusión y evitar muchos resultados adversos.

03 resultados

Para una caracterización estructural más completa de todos los uoxs,AutorSe utilizó el método de fluorescencia de escaneo diferencial (dsf) (34) para determinar la estabilidad térmica. Como se muestra en la figura s7, las formas de pico de uox - CBM 3 y uox - CBM 2 son más asimétricas, especialmente uox - CBM 2, lo que indica que la ruptura de CBM y uox induce la variabilidad sinérgica de varios dominios. Por el contrario, el pico DSF de cbm3 - Δ10aa - uox es el más simétrico y estrecho, lo que verifica su estabilidad estructural, lo que es consistente con los resultados de la simulación de Dinámica molecular y el análisis de SDS - page.

04 metodología

La estabilidad térmica de la proteína objetivo se evaluó utilizando el analizador de estabilidad de la proteína PSA - 16 producido por Beijing baiste Technology co., Ltd. Primero se diluye la muestra a una concentración de 0,5 mg / ML. Luego, la muestra diluida de 20 litros se colocó en un tubo de vidrio de cuarzo (número de producto lg - 002, también de Beijing baisite Technology co., ltd.).

La intensidad de fluorescencia de las proteínas endógenas a 330 nm y 350 nm se midió mediante escaneo de temperatura lineal. El rango de temperatura es de 23 a 97 grados celsius, y la tasa de calentamiento es de 1 Grado Celsius por minuto. La temperatura del punto medio de desnaturalización térmica (tm) se calcula de acuerdo con la pendiente de la curva f350 / f330. Cada muestra se midió cuatro veces seguidas.

05 resultados

En este estudio, los autores construyeron una serie de urasa de fusión CBM con la ayuda de estrategias de ingeniería enzimática guiadas por la estructura y exploraron los factores clave que afectan la estabilidad de la uox de fusión como elemento biosensor. los resultados muestran el papel clave de las regiones de anclaje interterritorial entre los residuos continuos del extremo n de CBM (p2, v3, s4, g5) y 158 a 163 bits (k158epmsn163) en la estabilidad estructural de la uox de fusión cbm. Después de eliminar los residuos inestables, la fiabilidad de los biosensores UA ha mejorado significativamente. Este estudio ayuda a construir racionalmente un uox fundido con características ajustables y predecibles, y proporciona un candidato ideal para la fabricación de excelentes biosensores de ua.

Para una caracterización estructural más completa de todos los uox,AutorLa determinación de la estabilidad térmica se realizó mediante fluorescencia de escaneo diferencial (dsf) (34). Como se muestra en la figura s7, las formas de pico de uox - CBM 3 y uox - cbm2 son más asimétricas, especialmente uox - cbm2, lo que indica una variabilidad sinérgica de múltiples dominios debido a la ruptura de CBM y uox. Por el contrario, el pico de fluorescencia de escaneo diferencial (dsf) de cbm3 - △10aa - uox es el más simétrico y estrecho, lo que confirma su estabilidad estructural, como lo demuestran las simulaciones de Dinámica molecular (md) y el análisis de la página de gel de Poliacrilamida de dodecilo (sds - page).